一、前言

1.生物學特征

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)為革蘭氏陰性菌，呈弧形或逗點狀，無芽胞，有菌毛，有些菌株有莢膜，一端有一根粗而長的鞭毛，運動活潑。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細菌運動極為活潑，呈穿梭樣或流星狀運動。液體培養(yǎng)物滴片染色鏡檢，可見排列如“魚群狀”弧菌。經人工培養(yǎng)后，易失去弧形而呈桿狀。

營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，在pH 6.8-10.2范圍均可生長，耐堿，在pH 8.8-9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好，因其他細菌在這pH不易生長，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養(yǎng)基。

在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，透明?；魜y弧菌對熱，干燥，日光，化學消毒劑和酸均很敏感，耐低溫：濕熱55℃，15分鐘，100℃，1-2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死；0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達到消毒目的；在正常胃酸中僅生存4分鐘。霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌，在16-44℃均可生長，最適生長溫度37℃。

2.流行病學特征

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是霍亂的病原菌，該病為一種急性烈性腸道傳染病，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，發(fā)病急，傳染性強，死亡率高，屬于國際檢疫傳染病。共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂?；魜y弧菌O1群和O139群是烈性腸道傳染病霍亂的病原體。在自然情況下，人類是霍亂弧菌的易感者。人通過攝入霍亂弧菌污染的食物或水，引起霍亂。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛運動穿過腸黏膜表面的黏液層，接近腸黏膜上皮細胞，通過普通菌毛的作用定植。腸道內的環(huán)境有利于霍亂弧菌的繁殖，產生霍亂腸毒素，導致疾病的發(fā)生。

霍亂弧菌的主要致病因素是霍亂毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致瀉毒素中最強烈的毒素,可造成腸液大量分泌，導致嚴重的嘔吐和腹瀉，使體內水分和電介質大量丟失，形成嚴重的水樣腹瀉綜合征?；魜y弧菌造成的主要病變均由嚴重脫水引起，臨床可見指紋皺縮，皮下組織及肌肉干癟。心、肝、脾等臟器均見縮小。內臟漿膜無光澤。腸腔高度擴張、腸內充滿泔水樣液體，腸粘膜松弛，但粘膜上皮完整，無潰瘍。膽囊內充滿粘稠膽汁。腎小球及間質的毛細管擴張，腎小管腫脹、變性及壞死。其他臟器也有出血、變性等變化。

二、檢驗過程

試驗參考標準為《SN/T 1022—2010 進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法》。本標準規(guī)定了進出口食品中霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的檢驗方法，適用于食品中霍亂弧菌的檢驗，動物飼料和其他食品生產和加工區(qū)域環(huán)境樣品中的霍亂弧菌檢驗可參照使用。

霍亂弧菌檢驗程序如圖1：

圖1

1.培養(yǎng)基鑒定及結果判斷

①TCBS培養(yǎng)基

原理：蛋白胨、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和生長因子；氯化鈉可刺激弧菌的生長；蔗糖是可發(fā)酵的糖類；牛膽酸鈉、牛膽粉、硫代硫酸鈉和枸櫞酸鈉及較高的pH 可抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群；硫代硫酸鈉與檸檬酸鐵反應作為檢測硫化氫產生的指示劑；溴麝香草酚藍和麝香草酚藍是pH指示劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

使用方式：稱取本品89g，煮沸溶解于1000ml蒸餾水中，冷至45-50℃時，傾入無菌平皿，備用。注：無需高壓滅菌。

結果：霍亂弧菌在TCBS上呈圓形，表面光滑，黃色，直徑2mm～3mm，具體試驗結果如圖2：

圖2 霍亂弧菌非01 TCBS培養(yǎng)基生長結果

②慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基

原理：蛋白胨、牛肉浸粉提供氮源、維生素、礦物質和生長因子；蔗糖提供碳源；氯化鈉即用于滿足霍亂弧菌嗜鹽生長的要求，同時形成了不利于其他細菌生長的高滲透壓；亞硫酸鈉可刺激弧菌生長；慶大霉素和亞碲酸鉀及較高的pH值，可抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性雜菌的生長；枸櫞酸鈉可使得霍亂弧菌免受其他抑菌物質的影響；霍亂弧菌對酸性環(huán)境比較敏感，因此該pH 值可促進其生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

使用方式：稱取本品56.0g，加熱攪拌溶解于1000ml蒸餾水中，冷至50℃左右時，加入無菌1%亞碲酸鉀溶液0.5ml，混勻，傾入無菌平皿，備用。無需高壓滅菌。

結果：霍亂弧菌在慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基上略帶青灰色，半透明，扁平微隆起，如延長培養(yǎng)或室溫放置，菌落中心形成黑色金屬碲沉淀，具體試驗結果如圖3：

菌落略帶青灰色，半透明，扁平微隆起

延長培養(yǎng)時間后，菌落中心形成黑色金屬碲沉淀

③氯化鈉三糖鐵瓊脂

原理：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和礦物質；乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發(fā)酵糖類，其被分解產酸時通過苯酚紅酸堿指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；因某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀；較高含量的氯化鈉可促進弧菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

使用方式：稱取本品69.5g，加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸使完全溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。

結果：霍亂弧菌在氯化鈉三糖鐵斜面上的反應為底層黃色，斜面黃色，不產生硫化氫，不產氣，具體試驗結果如圖4：

④氯化鈉營養(yǎng)瓊脂

原理：蛋白胨、牛肉浸粉提供微生物生長所需的碳氮源、維生素和生長因子；高含量的氯化鈉可促進霍亂弧菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

使用方式：稱取本品36.0g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min，備用。

結果：霍亂弧菌在氯化鈉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后菌落呈圓形，邊緣半透明中央不透明，直徑為3mm左右，具體試驗結果如圖5：

2.生化鑒定及結果判斷

①革蘭氏染色

所用試劑：革蘭氏染色液試劑盒。

原理：通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯(lián)致密，遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，因此，能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

結果：霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌，呈弧形或彎曲狀，染色結果如圖6：

②氧化酶試驗

所用試劑：氧化酶試紙。

原理：氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落，涂在試紙上。在30s內變?yōu)樗{色或藍紫色為陽性，不變色為陰性。

結果：挑選營養(yǎng)瓊脂上純培養(yǎng)的單個菌落進行氧化酶試驗，霍亂弧菌為氧化酶陽性，試驗結果如圖7：

③生化鑒定條試驗

所用試劑：青島海博HBI霍亂弧菌生化鑒定條（SN）。

試劑介紹：用于霍亂弧菌的生化鑒定。組成：ONPG、尿素酶、明膠、精氨酸雙水解酶肉湯、鳥氨酸脫羧酶肉湯、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、無鹽胰胨水、2%氯化鈉胰胨水、6%氯化鈉胰胨水、8%氯化鈉胰胨水、10%氯化鈉胰胨水、靛基質、1%氯化鈉乳糖、1%氯化鈉纖維二糖、1%氯化鈉阿拉伯糖、1%氯化鈉蔗糖、1%氯化鈉甘露糖、42℃生長試驗。(SN標準)。

操作過程：取一內盛2ml無菌生理鹽水試管，用接種針從氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板上挑取部分菌落至無菌生理鹽水中，仔細研磨制成0.5麥氏濁度的均一細菌懸液，取一無污染的生化鑒定條，每孔加入100ul菌懸液，其中固體和半固體生化管采用穿剌接種，鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸和氨基酸對照需加滅菌石蠟覆蓋液面。接種完后做好標記，蓋上蓋子，放入底托中，放置36℃±1℃培養(yǎng)（42℃生長置42℃培養(yǎng)）。培養(yǎng)結束后，記錄試驗結果。具體試驗結果如圖8：

霍亂弧菌非01生化鑒定結果表

生化項目

結果判定

生化形狀

生化項目

結果判定

生化形狀

ONPG

＋

黃色

8%氯化鈉蛋白胨水

﹣

不生長

尿素酶

﹣

黃色

10%氯化鈉蛋白胨水

﹣

不生長

明膠

＋

液態(tài)

1%氯化鈉甘露醇

＋

紅色

鳥氨酸

＋

紫色

1%氯化鈉乳糖

﹣

不變色

賴氨酸

＋

紫色

1%氯化鈉纖維二糖

﹣

不變色

氨基酸對照

﹣

黃色

1%氯化鈉阿拉伯糖

﹣

不變色

精氨酸

﹣

黃色

1%氯化鈉蔗糖

＋

紅色

無鹽蛋白胨水

＋

生長變渾濁

靛基質

＋

紅色環(huán)

2%氯化鈉蛋白胨水

＋

生長變渾濁

42℃生長試驗

＋

生長變渾濁

6%氯化鈉蛋白胨水

﹣

不生長

氧化酶

＋

紫色

注：＋表示陽性；﹣表示陰性

注意事項：1.靛基質試驗過程中，在培養(yǎng)結束后需加Kovacs氏靛基質試劑2-4滴，混勻后4h內觀察結果；2.鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸和氨基酸對照需加滅菌液體石蠟覆蓋液面。

三、結果總結

霍亂弧菌在TCBS上呈圓形，表面光滑，黃色，直徑2mm～3mm；在慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基上略帶青灰色，半透明，扁平微隆起，如延長培養(yǎng)或室溫放置，菌落中心形成黑色金屬碲沉淀；在氯化鈉三糖鐵斜面上的反應為底層黃色，斜面黃色，不產生硫化氫，不產氣；在氯化鈉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后菌落呈圓形，邊緣半透明中央不透明，直徑為3 mm左右；經革蘭氏染色試驗鑒定為革蘭氏陰性，呈弧形或彎曲狀；在氧化酶試紙上呈紫色，為陽性實驗結果；在無鹽蛋白胨胨水和2%氯化鈉蛋白胨水中生長；6%氯化鈉蛋白胨水、8%氯化鈉蛋白胨水生長旺盛為陽性和10%氯化鈉蛋白胨水中不生長；ONPG為陽性；尿素酶為陰性；明膠為陽性；鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶陽性；氨基酸對照和精氨酸為陰性；蔗糖、甘露醇為陽性；乳糖、纖維二糖和阿拉伯糖為陰性；靛基質試驗為陽性；在42℃恒溫培養(yǎng)箱中生長。除上述試驗，對霍亂弧菌的檢測亦可選做血清學分型等相關試驗。